Agathe Maupetit soutiendra sa thèse, intitulée “Potentiel évolutif et déterminisme génétique de caractères d’agressivité et morphologiques de l’agent de la rouille du peuplier,Melampsora larici-populina“, le mardi 18 décembre à 9h dans la salle de conférences à l’Inra, devant le jury suivant :

Marie Foulongne-Oriol, Chargée de recherche, INRA Bordeaux, Rapporteure
Bruno Le Cam, Directeur de recherche, INRA Angers, Rapporteur
Chloé Delmas, Chargée de recherche, INRA Bordeaux, Examinatrice
Katherine Hayden, Chercheuse, RGBE Edimbourg, Examinatrice
Cécile Robin, Directrice de recherche, INRA Bordeaux, Examinatrice
Pascal Frey, Directeur de recherche, INRA Nancy, Directeur de thèse
Fabien Halkett, Chargé de recherche, INRA Nancy, Co-directeur de thèse, invité
Stéphane De Mita, Chargé de recherche, INRA Nancy, Co-directeur de thèse, invité

Agathe Maupetit will defend her PhD thesis, entitled “Evolutionary potential and genetic underpinnings of aggressiveness and morphological traits in the poplar rust fungus,Melampsora larici-populina“, on Tuesday, December 18 at 9:00 am in the conference room at INRA.

Résumé :Pour lutter contre les agents phytopathogènes, la sélection de plantes résistantes est la stratégie la plus rentable et la plus écologique. Les résistances quantitatives, basées sur des mécanismes de résistances complexes, sont connues pour être sujettes à l’érosion, en cas d’évolution de l’agressivité des agents pathogènes. L’objectif de ce travail basé sur le pathosystème peuplier – rouille du peuplier(Melampsora larici-populina) est d’évaluer le potentiel évolutif des caractères d’agressivité et morphologiques du parasite par des approches de génétique quantitative et d’identifier les bases génétiques par génétique d’association. Pour estimer la plasticité, l’héritabilité et les compromis évolutifs d’un ensemble de caractères quantitatifs, nous avons précisément mesuré leurs variations dans quatre populations contrastées du champignon. Nous avons montré que le volume des spores est un caractère héritable qui évolue rapidement. La quantité de mycélium in plantaest aussi héritable mais très conservée car sous sélection stabilisante dans les populations étudiées. Le temps de latence, la taille des lésions et le taux de sporulation présentent une héritabilité faible, ce qui explique l’absence d’évolution observées au cours du temps pour ces trois caractères. Les caractères liés à la fonction de sporulation semblent être les plus plastiques le long d’un gradient de maturité foliaire. L’ensemble de ces résultats suggère que la sporulation est la fonction la plus contrainte par l’environnement biotique et donc la meilleure cible pour la mise en place de résistances durables chez le peuplier. Si aucune base génétique de ces caractères quantitatifs n’a été mise en évidence, nous avons localisé un locus d’avirulence potentiel (Avr7) sur lequel une caractérisation fonctionnelle est envisagée.

Mots clés :Champignon phytopathogène, génétique quantitative, évolution, pouvoir pathogène, GWAS (étude d’association sur génome complet)

Abstract:To control plant pathogens, breeding resistant plants is the most cost-effective and ecological strategy. Quantitative resistances, which are based on complex plant mechanisms, are known to be exposed to erosion through an increase of pathogens aggressiveness. Through the study the poplar – poplar rust (Melampsora larici-populina) pathosystem, this work aims to estimate the evolutionary potential of aggressiveness and morphological traits using quantitative genetic approaches and to identify molecular bases through genome-wide association study. To estimate plasticity, heritability, and trade-offs for a set of quantitative traits, we precisely measured their variation in four contrasted pathogen populations. It appeared that spore volume is highly heritable and evolved rapidly. In plantamycelium quantity is also heritable but constant because of stabilizing selection occurring in the studied populations. Latent period, lesion size and sporulation rate exhibit low heritability, which explains the absence of evolution during the studied time period. Traits involved in the sporulating function seem to be the most plastic ones along a leaf maturity gradient. Altogether, these results suggest that sporulating function is the more constraint by the biotic environment and thus the best target for the construction of durable resistance in poplar. No genetic underpinning has been found for quantitative traits, but we have identified a potential avirulence locus (Avr7), opening the way for its functional characterization.

Key words:fungal plant pathogen, quantitative genetics, evolution, pathogenicity, GWAS (genome-wide association study)

François Maillard soutiendra publiquement ses travaux de thèse portant sur :

Le rôle des communautés microbiennes dans la dégradation de la matière organique en forêt dans un contexte d’exportation intense de biomasse 

 

Dirigés par Marc Buée et Dominique Gérant le 26 octobre à 9h00
Salle de conférence
Centre INRA Grand Est – Nancy
Champenoux

Jury

Patricia Luis, Maître de Conférences, Université de Lyon (Rapporteur)
François Buscot, Prof. Dr., Helmholtz Centre for Environmental Research (Rapporteur)
Daniel Epron, Professeur des Universités, Université de Lorraine (Examinateur)
François Rineau, Prof. Dr., University of Hasselt (Examinateur)

 
Résumé :
En Europe, le bois est la première source d’énergie renouvelable. La transition énergétique se traduit par une intensification de l’exploitation des forêts. L’effet de ces pratiques sylvicoles sur les communautés microbiennes du sol est encore peu étudié. Au cours de ma thèse, j’ai évalué les conséquences d’une manipulation artificielle de matière organique en forêt tempérée sur la diversité fonctionnelle et taxonomique des communautés bactériennes et fongiques telluriques dans six sites expérimentaux (réseau expérimental MOS). Parallèlement, une caractérisation fonctionnelle des communautés microbiennes a également été réalisée dans un contexte proche des réalités de l’intensification des pratiques sylvicoles sous climat tropical en plantation d’Eucalyptus. Si certains descripteurs fonctionnels de la dégradation de la matière organique sont particulièrement informatifs, les activités microbiennes de dégradation de la chitine, polymère azoté des arthropodes et champignons, sont apparues très sensibles au retrait de matière organique. C’est pourquoi, par des approches de génomiques comparatives, nous avons cherché à estimer le potentiel chitinolytique des différentes guildes fongiques des sols. En conditions contrôlées, nous avons ensuite quantifié les capacités potentielles de mobilisation et de transfert du carbone et de l’azote, à partir d’une matière organique microbienne riche en chitine, par un champignon ectomycorhizien en symbiose avec son hôte. Enfin, la généricité des fonctions chitinolytiques d’un plus large spectre d’espèces fongiques ectomycorhiziennes a été évaluée par le couplage d’approches enzymatiques et isotopiques. L’ensemble de nos résultats met en lumière le rôle significatif des champignons ectomycorhiziens dans la mobilisation du carbone et de l’azote à partir de certaines formes de matière organique, et la nécessité de prendre en compte le compartiment microbien dans les études d’impact des pratiques sylvicoles.

 
Abstract:

One of the main usages of wood in Europe is renewable energy supply that implies intensification of forest management to respond to this increasing demand. However, the impact of intense forestry practices on soil microbial communities remains poorly investigated. In the frame of my PhD thesis, I evaluated effects of artificial organic matter removal on functional and taxonomical diversity of soil bacterial and fungal communities in temperate forest, using six experimental sites across France (INRA MOS experimental network). In parallel, I also characterised impact of intensified forest management practices on functional microbial communities in tropical plantation of Eucalyptus trees. This work permitted to identify several sensitive functional indicators of organic matter degradation. Notably, the degradation of chitin – a nitrogen polymer main component of arthropods and fungal cell walls – was revealed to be particularly sensitive to organic matter removal. Genomics and enzymatic approaches were then used to estimate chitinolytic potentials of the different genera of soil fungi. In controlled conditions, we were able to quantify ectomycorrhizal fungus carbon and nitrogen mobilisation and transfer capacities from chitin enriched organic matter to its host during symbiotic interaction. Finally, we evaluated chitinolytic functions of ectomycorrhizal fungi at large scale by combining enzymatic and isotopic approaches. Taken together, the results acquired in the frame of my PhD thesis, illustrate the significant role of ectomycorrhizal fungi in carbon and nitrogen mobilisation from organic matter. We particularly highlight that microbial compartment in soil must be considered in studies of forest management practices.

Thomas Perrot soutiendra publiquement ses travaux de thèse portant sur :

La diversité fonctionnelle des systèmes de détoxication chez les champignons lignolytiques

 Dirigés par Eric Gelhaye et Mélanie Morel-Rouhier le 26 septembre à 14h00 Amphithéâtre 7, Faculté des Sciences et Technologies, Vandœuvre-lès-Nancy

Résumé :

Les champignons décomposeurs du bois jouent un rôle important dans le cycle du carbone en participant notamment au recyclage de la matière organique. Outre leur aptitude à minéraliser la biomasse lignocellulosique, ces organismes ont la capacité de dégrader des molécules potentiellement toxiques libérées lors de ce processus. Leur système de détoxication comprend différentes familles multigéniques dont les glutathion transférases. Ces enzymes ubiquitaires, sont regroupées en différentes classes dans le règne fongique, certaines d’entre elles étant étendues chez ces champignons. Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse consistait à appréhender les fonctions des glutathion transférases de la classe Omega (GSTOs) étendue chez Trametes versicolor, un champignon de pourriture blanche. Une approche biochimique et structurale a été menée sur neuf protéines produites de façon recombinante. Dans un premier temps, une caractérisation enzymatique de ces isoformes a été réalisée à l’aide de substrats synthétiques montrant une similarité des propriétés catalytiques. Puis, à partir d’une banque de molécules pures et de mélanges complexes issus de différentes essences forestières, une méthode de screening à haut débit a permis d’identifier des ligands potentiels de ces enzymes. La résolution de la structure tridimensionnelle de trois isoformes a démontré l’état homodimérique de ces protéines et l’implication de deux sites de fixation dans la reconnaissance de ces ligands : le site H (présent dans chaque monomère) et le site L (à l’interface du dimère). Par exemple, l’isoforme TvGSTO3S est capable de fixer dans son site H plusieurs hydroxybenzophénones, mais également un flavonoïde, la dihydrowogonine. Dans ce dernier cas, cette interaction avec un ligand naturel issu d’extraits de bois de merisier a été démontré par une approche de cristallographie d’affinité. D’autre part, des expériences de co-cristallisation ont permis de détecter deux molécules d’un autre flavonoïde, la naringénine, dans le site L de l’isoforme TvGSTO6S. Enfin, une interaction spécifique impliquant les sites H et L de l’isoforme TvGSTO2S a été démontrée avec l’oxyresvératrol. L’analyse structurale a révélé que les deux configurations du stilbène étaient liées à la protéine : la configuration transdans le site H et la configuration cisdans le site L. Ainsi, malgré une redondance fonctionnelle partielle, ces recherches ont démontré l’existence d’un spectre d’interactions spécifiques pour chaque isoforme testée. Le caractère étendu de la classe Omega indiquerait que ces enzymes seraient impliquées dans l’adaptation du champignon à son environnement. En effet, les ligands identifiés au cours de ces travaux suggèrent que les propriétés « ligandines » des TvGSTOs joueraient un rôle dans la détoxication des produits issus de dégradation du bois.

Abstract:

Wood decaying fungi play an important role in the carbon cycle by participating in the recycling of organic matter. In addition to their ability to mineralize lignocellulosic biomass, these organisms have the ability to degrade potentially toxic molecules released during this process. Their detoxification system involves several multigenic families including glutathione transferases. These ubiquitous enzymes are grouped into several classes in the fungal kingdom, some of them are widespread in these fungi. In this context, the main objective of this thesis was to understand the functions of glutathione transferases of the Omega class (GSTOs) extended in Trametes versicolor, a white rot fungus. A biochemical and structural approach was led using nine recombinant proteins. Firstly, enzymatic characterization of these isoforms was performed using synthetic substrates, the obtained results demonstrating a similarity of catalytic properties. Then, using a library of pure molecules and another one of complex mixtures from different forest species, a high throughput screening method was applied to identify potential ligands for these enzymes. The resolution of the three-dimensional structure of three isoforms demonstrated the homodimeric state of these proteins and the involvement of two binding sites in the recognition of these ligands: the H site (present in each monomer) and the L site (at the dimer interface). For example, the isoform TvGSTO3S is able to bind several hydroxybenzophenones in its H site, but also a flavonoid, dihydrowogonin. In this case, this interaction with a natural ligand derived from wild-cherry tree extract was demonstrated by an affinity crystallography approach. On the other hand, co-crystallization experiments detected two molecules of another flavonoid, naringenin, in the L site of the isoform TvGSTO6S. Finally, a specific interaction involving the H and L sites of the isoform TvGSTO2S was demonstrated with oxyresveratrol. Structural analysis revealed that the presence of  both configurations of the stilbene in the protein: the transconfiguration in the H site and the cisconfiguration in the L site. Thus, despite partial functional redundancy, this research demonstrated the existence of a specific pattern of interactions for each tested isoform. The expansion of the Omega class could indicate that these enzymes are involved in the adaptation of the fungus in its environment. Indeed, the ligands identified during this work suggest that the “ligandin” properties of TvGSTOs play a role in detoxifying wood degradation products.

PhD defense the 28th of March at 1.30 p.m. in the conference room of the INRA center in Champenoux.

Résumé:

La maladie de la rouille foliaire du peuplier est causée par des espèces de champignons de la famille des Melampsoraceae et de l’ordre des Pucciniales. Trois espèces infectent principalement les peupleraies en France : Melampsora larici-populina qui est la plus agressive, Melampsora allii-populina et Melampsora medusae f. sp. deltoidae. Dans leurs cycles de vie, ces trois espèces partagent les peupliers comme hôtes communs pour assurer leur multiplication clonale au cours de l’été et elles infectent des hôtes différents pour réaliser leur cycle sexué au cours du printemps. Chez les champignons pathogènes biotrophes obligatoires comme les Pucciniales, la sécrétion de molécules appelées effecteurs conditionne le succès d’infection de la plante hôte. Ainsi, les effecteurs permettent de manipuler les fonctions cellulaires de l’hôte et de contourner son système immunitaire. Comprendre le rôle fondamental de ces molécules dans la cellule-hôte est une des questions clés de la biologie des effecteurs. Au cours de cette thèse, des approches de génomique, de transcriptomique et de caractérisation fonctionnelle et structurale d’effecteurs candidats ont été déployées afin de contribuer à l’analyse moléculaire de l’interaction entre peupliers et Melampsora spp. Premièrement, l’analyse du transcriptome de M. larici-populina au cours de son cycles sexué a mis en évidence que les protéines sécrétées sont surreprésentées parmi les gènes surexprimés dans les basides et au cours de l’infection de l’hôte mélèze. La comparaison des transcriptomes de M. larici-populina lors de l’infection des deux hôtes, le peuplier et le mélèze, révèle la présence d’une majorité de gènes exprimés communément chez les deux hôtes et une fraction exprimée spécifiquement chez chacun des deux hôtes. Ainsi, nous révélons des gènes codant de petites protéines sécrétées qui pourraient être associés à la spécificité d’hôte. Deuxièmement, le séquençage du génome de M. allii-populina et sa comparaison au génome de M. larici-populina a révélé une expansion de sa taille (336 Mb contre 110 Mb). Cette dernière est associée à l’invasion du génome par de nombreux éléments transposables qui représentent près de 75% du génome et par un enrichissement en gènes par rapport à M. larici-populina (23 089 gènes contre 19 550). Cependant, les répertoires de gènes potentiellement impliqués dans le processus infectieux sont proportionnellement sensiblement similaires entre les deux espèces. Les quelques différences observées pourraient être associées à la spécificité d’hôte (Populus spp./Larix spp. dans un cas et Populus spp./Allium spp. dans l’autre) et à l’adaptation à des hôtes alternants différents. Troisièmement, des cribles effectoromiques réalisés sur un répertoire d’effecteurs candidats de M. larici-populina ont révélé deux candidats d’intérêt. Nous avons mis en place des approches fonctionnelles pour tenter d’élucider leur rôle dans l’interaction avec le peuplier. Nous avons ainsi pu produire l’effecteur MLP124017 qui interagit avec des protéines de la famille Topless-related proteins et résoudre sa structure tridimensionnelle qui présente une similarité à des protéines nuclear transport factor 2 like qui sont des protéines cargo transportant diverses molécules entre le noyau et le cytoplasme. L’effecteur Chloroplast-Targeted Protein MLPCTP1 est adressé vers et est localisé dans les chloroplastes via un peptide de transit dans le système hétérologue Nicotiana benthamiana et nous montrons une localisation similaire chez le peuplier et l’arabette. Les fonctions de ces effecteurs restent encore à déterminer mais les travaux amorcés dans cette thèse ouvrent de nouvelles perspectives quant à la diversité et au rôle des effecteurs chez les Pucciniales.

Abstract:

The poplar rust disease is caused by fungi belonging to the order Pucciniales in the family Melamsporaceae. Three main species cause damages in poplar plantations in France: Melampsora larici-populina, which is the most aggressive, Melampsora allii-populina and Melampsora medusae f. sp. deltoidae. During their life cycles, these three fungi share poplars as main host in which they achieve their clonal multiplication during summer and they infect different alternate hosts to complete their sexual reproduction in spring. In fungal obligate biotrophs like rust fungi, the success of host infection is conditioned by the secretion of molecules called effectors. Effectors allow the pathogen to manipulate host cell processes and to evade the plant immune system. A key question in effector biology is to understand how these molecules function in the host cell. In the frame of this PhD thesis, genomics, transcriptomics, functional and structural approaches were used to contribute to the molecular analysis of the poplar-Melamspora spp. interaction. Firstly, the transcriptome analysis of M. larici-populina during its sexual cycle highlighted that small-secreted proteins were over-represented among genes up-regulated in basidia and during larch infection. Comparison of M. larici-populina transcriptomes during infection of the two hosts, poplar and larch, revealed that a majority of the genes are commonly expressed on both hosts and a fraction is specifically expressed on each host. Small-secreted protein genes specifically expressed on each host maybe related to host specificity. Secondly, the sequencing of the M. allii-populina genome and the comparison with M. larici-populina revealed a size expansion in M. allii-populina (336Mb vs. 110Mb). This expansion is mostly due to the invasion of the genome by numerous transposable elements that represent more than 75% of the genome and by a gene enrichment compared to M. larici-populina (23,089 and 19,550 genes, respectively). However, catalogues of gene potentially involved in the infection process are proportionally similar between the two species. The few differences observed could be linked to host specificity (Populus spp./Larix spp. on one hand and Populus spp./Allium spp. on the other hand) and adaptation to their different hosts. Thirdly, effectoromic screens developed on a panel of M. larici-populina candidate effectors revealed two candidates of interest. We set up a pipeline of functional approaches in order to elucidate their role in the interaction with poplar. We produced the candidate effector MLP124017 that interacts with proteins of the Topless-related proteins family and solved its structure that presents similarities with nuclear transport factor 2 like proteins. These proteins are cargos that transport diverse molecules between the nucleus and cytosol in plant cells. The effector Chloroplast-Targeted Protein MLPCTP1 is addressed and translocated inside chloroplasts through a transit peptide in the heterologous system Nicotianana benthamiana and we showed that the same localization occurs in poplar and in Arabidopsis. The functions of these two effectors remain to be determined but the functional characterization initiated in this thesis opens new perspectives in term of diversity and roles of effectors in rust fungi.